【操作開始】
一、準備酶切目的DNA（RT-PCR的產物）
1、點擊“準備酶切目的DNA” ----桌面右側出現DNA， 10×Buffer，限制性內切酶， ddH20，左側:實驗儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。
實驗提示：準備EP管
2、準備EP管 ----點擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標置于EP管上，說明框內顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；
實驗提示：準備加入目的DNA
3、加入RT-PCR產物（目的DNA）---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取15ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有RT-PCR產物處，點擊RT-PCR產物（槍頭內顯示吸取15ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：下一步選擇兩種限制性內切酶。
4、選擇限制性內切酶---- 1點擊限制性內切酶，出現對話框，出現RT-PCR產物序列：AACGAATTCACAATGGTCAGATCATCTTCT…
…TTTGGGATCATTGCCCTGTAAGGATCCAAA
及備選擇的5種內切酶及各自切割位：SCA I:AGTACT ,
BamH I:GGATCC,
PVU Ⅰ:CGATCG,
ECOR I:GAATTC,
PVU Ⅱ:CAGCTG,
XMN I: GAANNN TTC。
各個酶前面有一個選擇框，點擊即為選擇用。選擇“BamH I”和“ECOR I”提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他組合提示“選擇錯誤，請重新選擇”。
實驗提示：加入選中的限制性內切酶
5、加入限制性內切酶---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有BamH I處，點擊（槍頭內顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，微量吸液器回到原位置。⑤點擊微量吸液器，拖動至盛有ECOR I處，點擊（槍頭內顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示: 加入10×Buffer
6、加入10×Buffer ----點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至10×Buffer處，點擊10×Buffer（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入ddH2O
7、加入ddH2O ----①點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至ddH2O處，點擊ddH2O（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：振蕩混勻
8、振蕩---- 1點擊振蕩器，振蕩器出現在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉振蕩，④點擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現在工作臺中央。
實驗提示：限制酶酶切
9、酶切---- 1點擊恒溫槽，恒溫槽出現在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內，③出現選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點擊“開始酶切”，則出現酶切畫面，并出現定時器，時間快速轉動，至提示4小時后酶切結束。畫面顯示有粘性末端的DNA形成，3秒鐘后隱去。
實驗提示：準備酶切載體DNA
二、準備酶切載體DNA（質粒DNA）
1、點擊“準備酶切載體DNA（質粒DNA）” ----桌面右側出現載體DNA， 10×Buffer，限制性內切酶，堿性磷酸酶，ddH20，左側:實驗儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。
實驗提示：準備EP管
2、準備EP管 ----點擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標置于EP管上，說明框內顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；
實驗提示：準備加入質粒DNA
3、加入質粒DNA---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取15ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有載體DNA處，點擊載體DNA（槍頭內顯示吸取15ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：下一步選擇兩種限制性內切酶
4、選擇限制性內切酶---- 1點擊限制性內切酶，出現對話框，出現RT-PCR產物序列：AACGAATTCACAATGGTCAGATCATCTTCT…
…TTTGGGATCATTGCCCTGTAAGGATCCAAA
及備選擇的5種內切酶及各自切割位：SCA I:AGTACT ,
BamH I:GGATCC,
PVU Ⅰ:CGATCG,
ECOR I:GAATTC,
PVU Ⅱ:CAGCTG,
XMN I: GAANNN TTC。
各個酶前面有一個選擇框，點擊即為選擇用。選擇“BamH I”和“ECOR I”提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他組合提示“選擇錯誤，請重新選擇”。
實驗提示：加入選中的限制性內切酶
5、加入限制性內切酶---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有BamH I處，點擊（槍頭內顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，微量吸液器回到原位置。⑤點擊微量吸液器，拖動至盛有ECOR I處，點擊（槍頭內顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示: 加入10×Buffer
6、加入10×Buffer ----點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至10×Buffer處，點擊10×Buffer（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入ddH2O
7、加入ddH2O ----點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至ddH2O處，點擊ddH2O（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：振蕩
8、振蕩---- 1點擊振蕩器，振蕩器出現在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉振蕩，④點擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現在工作臺中央。
實驗提示：酶切質粒DNA
9、酶切---- 1點擊恒溫槽，恒溫槽出現在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內，③出現選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點擊“開始酶切”，則出現酶切畫面，并出現定時器，時間快速轉動，至提示4小時后酶切結束。
實驗提示：加入堿性磷酸酶
10、加入堿性磷酸酶----點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至堿性磷酸酶處，點擊堿性磷酸酶（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：振蕩混勻
11、振蕩---- 1點擊振蕩器，振蕩器出現在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉振蕩，④點擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現在工作臺中央。
實驗提示：堿性磷酸酶切除質粒DNA5’-末端的磷酸基團
12、酶切---- 1點擊恒溫槽，恒溫槽出現在工作臺中央；3移動振蕩后的EP管至恒溫槽內，③出現選擇恒溫槽溫度對話框，“1：16℃”，“2：37℃”，“3：42℃”，選擇“37℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點擊“開始酶切”，則出現酶切畫面，并出現定時器，時間快速轉動，至提示4小時后酶切結束。畫面顯示有粘性末端的載體DNA形成“半環狀”，3秒鐘后隱去。
實驗提示：連接反應
三、連接反應
1、點擊“開始連接反應” ----桌面右側出現有粘性末端的DNA，有粘性末端的載體DNA，10×DNA連接Buffer，DNA連接酶，ddH20，左側:實驗儀器：振蕩器，恒溫槽，EP管。
實驗提示：準備EP管
2、準備EP管----點擊EP管，并拖動至工作臺中央（EP管外顯示刻度0.5ml，1.0ml，鼠標置于EP管上，說明框內顯示“1.5mlEP管”，3秒鐘后隱去）；
實驗提示：加入酶切后目的DNA
3、加入酶切后的目的DNA---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取10ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“20ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有酶切后的目的DNA處，點擊酶切后的目的DNA（槍頭內顯示吸取10ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入酶切后的質粒DNA
4、加入酶切后的質粒DNA---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取5ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“10ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有有粘性末端的載體DNA處，點擊酶切后的質粒 DNA（槍頭內顯示吸取5ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入10×DNA連接Buffer
5、加入10×DNA連接Buffer ---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“10ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有10×DNA連接Buffer處，點擊10×DNA連接Buffer（槍頭內顯示吸取2ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入DNA連接酶
6、加入DNA連接酶---- 1 點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取0.25ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“1ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至盛有DNA連接酶處，點擊DNA連接酶（槍頭內顯示吸取0.25ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：加入ddH2O
7、加入ddH2O ----點擊微量吸液器（說明框顯示“吸取2.75ul液體”，3秒鐘后隱去）；2 點擊裝有消毒槍頭的塑料盒（說明框顯示“5ul槍頭”，3秒鐘后隱去），加入到微量吸液器上；3點擊微量吸液器，拖動至ddH2O處，點擊ddH2O（槍頭內顯示吸取2.75ul紅色液體）；4拖動微量吸液器至EP管處，EP管蓋子打開，點擊微量吸液器（出現槍頭內液體注入EP管內的畫面），液體注入后，EP管蓋子蓋上，微量吸液器槍頭自動至垃圾桶，微量吸液器回到原位置。
實驗提示：振蕩器振蕩
8、振蕩---- 1點擊振蕩器，振蕩器出現在工作臺中央。②移動加完樣的EP管至振蕩器上方，③點擊“開始振蕩”，EP管開始在振蕩器上方旋轉振蕩，④點擊“停止”，即停止振蕩，振蕩器消失，EP管出現在工作臺中央。
實驗提示：恒溫槽連接
9、恒溫槽連接---- 1點擊恒溫槽，恒溫槽出現在工作臺中央；②移動振蕩后的EP管至恒溫槽內，③出現選擇恒溫槽溫度對話框，“1：4℃”，“2：16℃”，“3：42℃”，選擇“16℃”則提示“選擇正確”，對話框消失，如選擇其他則提示“選擇錯誤，請重新選擇”④點擊“開始連接”，則出現連接畫面，圖中顯示酶切后的目的DNA和酶切后的質粒DNA逐漸靠近連接，連接在一起后提示：“DNA重組成功”。
