背景

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），又(you)稱內毒素，為革蘭氏陰(yin)性菌細(xi)(xi)胞壁(bi)外壁(bi)的(de)(de)組成成分(fen)，可作用于膜受(shou)體(ti)激活多種細(xi)(xi)胞（巨噬細(xi)(xi)胞、上皮細(xi)(xi)胞、內皮細(xi)(xi)胞等）信號轉導系統，促進促炎(yan)(yan)(yan)細(xi)(xi)胞因(yin)子和(he)其(qi)他(ta)炎(yan)(yan)(yan)性介質的(de)(de)合成及(ji)釋放，引(yin)發炎(yan)(yan)(yan)癥反應。客戶采用LPS誘導RAW264.7巨噬細(xi)(xi)胞建立體(ti)外炎(yan)(yan)(yan)癥模型(xing)，使用超聲波細(xi)(xi)胞粉碎機將蛋(dan)白(bai)及(ji)核酸從炎(yan)(yan)(yan)癥細(xi)(xi)胞中(zhong)分(fen)離出(chu)來，從基因(yin)、蛋(dan)白(bai)相對表(biao)達水(shui)平方面評估羊棲菜多酚（Hizikia fusiformis polyphenols，HFPs）的(de)(de)抗炎(yan)(yan)(yan)活性，為其(qi)在新型(xing)抑炎(yan)(yan)(yan)制劑的(de)(de)開發利用提(ti)供(gong)理論依據。

材料與方(fang)法

1.1?棲菜多酚的制備

取?燥(zao)?棲(qi)菜粉(fen)末(mo)，加?體積分數60%?醇(chun)溶(rong)液，使?SCIENTZ-IID超聲輔助浸提(ti)（料液?1∶20（m/V）、50 ℃、60 min），抽濾后真空減壓蒸(zheng)餾去除?醇(chun)，獲(huo)?棲(qi)菜粗多(duo)酚溶(rong)液，依次(ci)采?等體積?油醚、?酸?酯分級萃取，真空減壓蒸(zheng)餾后凍(dong)?（使?SCIENTZ-12N過夜凍(dong)?），獲(huo)得HFPs粉(fen)末(mo)。測得HFPs粉(fen)末(mo)總酚含量(liang)為23.67±0.24 mg/g。利??菌(jun)?配(pei)制成多(duo)酚?液，再(zai)以(yi)細胞培(pei)養液稀釋?不(bu)同濃度，?于后續(xu)實(shi)驗。

1.2 炎癥(zheng)細胞(bao)培養

使?完(wan)全培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)（含10%（體積(ji)分(fen)數，下同）胎??清(qing)(qing)和1%?鏈霉素雙(shuang)抗(kang)DMEM培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)）培(pei)(pei)(pei)養(yang)RAW264.7細胞，37 ℃、5% CO2培(pei)(pei)(pei)養(yang)，細胞融合度(du)約80%時進?傳(chuan)代。然(ran)后(hou)分(fen)成3組進?培(pei)(pei)(pei)養(yang)：①陰性對(dui)照組，僅加?含10%胎??清(qing)(qing)的DMEM培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)；②LPS陽性對(dui)照組，加?含LPS（1μg/mL）和10%胎??清(qing)(qing)的DMEM培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)刺(ci)激(ji)24 h；③HFPs+LPS組，經含不同質量濃度(du)（10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、250、300、350 μg/mL）HFPs和10%胎??清(qing)(qing)的DMEM培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)培(pei)(pei)(pei)養(yang)24    h后(hou)，以含LPS（1 μg/mL）和10%胎??清(qing)(qing)的DMEM培(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)刺(ci)激(ji)24h。

1.3 RAW264.7細胞炎癥(zheng)相(xiang)關(guan)基因相(xiang)對表達量的(de)測定

1.2中培(pei)(pei)養的(de)(de)三組細(xi)胞培(pei)(pei)養結束后棄去(qu)培(pei)(pei)養液(ye)，?0.01 mol/L、pH 7.2的(de)(de)磷酸鹽緩沖液(ye)（phosphate buffered saline，PBS）清洗(xi)細(xi)胞2 次(ci)(ci)，每孔加?500 μL TRIzol試(shi)劑，使?SCIENTZ-IID加速破(po)碎細(xi)胞協助提取(qu)總RNA，超(chao)聲參數為：100 W，1 s 開1 s關，共1 min，并將RNA逆(ni)轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采(cai)?SYBR Green嵌合(he)熒(ying)光(guang)法(fa)與引物進?實(shi)時熒(ying)光(guang)定量PCR。測定?的(de)(de)基因（IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS）和內參基因次(ci)(ci)?嘌呤(ling)磷酸核糖基轉移酶(mei)1（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，hprt1）Ct值(zhi)，采(cai)?2－ΔΔCt法(fa)計算(suan)?的(de)(de)基因的(de)(de)相對表達量。

1.4 MAPKs、NF-κB信(xin)號通(tong)路關(guan)鍵蛋?相對表達量測定

1.2中(zhong)培(pei)養的(de)三組細(xi)胞(bao)培(pei)養結(jie)束后棄去培(pei)養液(ye)(ye)(ye)，?0.01 mol/L、pH 7.2的(de)磷酸(suan)(suan)鹽(yan)緩沖液(ye)(ye)(ye)（phosphate buffered saline，PBS）清洗細(xi)胞(bao)2 次，加(jia)?200 μL RIPA細(xi)胞(bao)裂解液(ye)(ye)(ye)，使?SCIENTZ-IID加(jia)速破碎細(xi)胞(bao)協(xie)助提取蛋(dan)(dan)(dan)?質，超聲參數為(wei)：100 W，1 s 開1 s關，共1 min，離?（12000 r/min、4 ℃）10 min取上清液(ye)(ye)(ye)。采?BCA蛋(dan)(dan)(dan)?質量濃度測定(ding)試劑(ji)盒(he)測定(ding)各組蛋(dan)(dan)(dan)?濃度，?蛋(dan)(dan)(dan)?上樣緩沖液(ye)(ye)(ye)調整蛋(dan)(dan)(dan)?質量濃度為(wei)2 mg/mL，95 ℃加(jia)熱(re)10 min使蛋(dan)(dan)(dan)?變性然后進(jin)???烷基硫(liu)酸(suan)(suan)鈉-聚丙(bing)烯酰胺(an)凝?電泳分(fen)離；濕轉到(dao)聚偏?氟?烯膜(mo)；5%（質量分(fen)數）脫脂奶粉(fen)（TBST溶液(ye)(ye)(ye)配(pei)制）封閉1 h；?抗4 ℃孵(fu)育12 h；?抗室溫(wen)孵(fu)育2 h；加(jia)?ECL試劑(ji)進(jin)?顯?反(fan)應，測定(ding)蛋(dan)(dan)(dan)?條帶灰度值。以β-actin為(wei)內參，?的(de)蛋(dan)(dan)(dan)?包括iNOS、p65、p-p65、p38、p-p38、JNK和pJNK，分(fen)別以p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-p65/p65表?相應蛋(dan)(dan)(dan)?磷酸(suan)(suan)化?平。

結果與(yu)分析

01.RAW264.7細胞炎癥相(xiang)關基因相(xiang)對表(biao)達量(liang)的測定結果

采?實時熒光定(ding)量PCR測定(ding)HFPs對(dui)(dui)(dui)LPS誘(you)(you)(you)導的巨噬細(xi)(xi)(xi)胞中重要(yao)促(cu)(cu)炎(yan)(yan)細(xi)(xi)(xi)胞因(yin)?IL-1β、IL-6和接觸式超聲在(zai)胞內蛋?及(ji)核酸提取過程中的應?TNF-α基(ji)因(yin)相對(dui)(dui)(dui)表(biao)(biao)達(da)量，以及(ji)炎(yan)(yan)癥(zheng)相關(guan)酶COX-2基(ji)因(yin)相對(dui)(dui)(dui)表(biao)(biao)達(da)量的影響。如圖(tu)1所(suo)?，LPS刺(ci)激不同時間后，所(suo)有(you)炎(yan)(yan)癥(zheng)介質的mRNA表(biao)(biao)達(da)?平均(jun)顯(xian)(xian)著提?（P＜0.05）。HFPs對(dui)(dui)(dui)促(cu)(cu)炎(yan)(yan)細(xi)(xi)(xi)胞因(yin)?的抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)作?與其劑(ji)量、LPS誘(you)(you)(you)導時間及(ji)細(xi)(xi)(xi)胞因(yin)?種類相關(guan)。與LPS組相?，靜息狀態細(xi)(xi)(xi)胞經HFPs處理再經LPS誘(you)(you)(you)導12、24 h后，IL-1β和IL-6的基(ji)因(yin)相對(dui)(dui)(dui)表(biao)(biao)達(da)量顯(xian)(xian)著下(xia)降；HFPs顯(xian)(xian)著抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)LPS誘(you)(you)(you)導3 h后TNF-α基(ji)因(yin)的相對(dui)(dui)(dui)表(biao)(biao)達(da)，?在(zai)LPS誘(you)(you)(you)導6?24 h的抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)作?總體(ti)不明顯(xian)(xian)。在(zai)LPS誘(you)(you)(you)導24 h，較低劑(ji)量HFPs（30、60 μg/mL）預(yu)處理對(dui)(dui)(dui)COX-2基(ji)因(yin)表(biao)(biao)達(da)具有(you)顯(xian)(xian)著抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)作?，但提?劑(ji)量后該抑(yi)(yi)制(zhi)(zhi)效果消失，甚(shen)?出現反向促(cu)(cu)進作?，120 μg/mL HFPs預(yu)處理促(cu)(cu)使COX-2相對(dui)(dui)(dui)表(biao)(biao)達(da)量較LPS組顯(xian)(xian)著上升（P＜0.05）。

02.MAPKs、NF-κB信號通路關(guan)鍵蛋?相對表達量測(ce)定結(jie)果

采?蛋(dan)?免疫(yi)印(yin)跡法(fa)測定巨噬細(xi)胞(bao)中(zhong)MAPKs和(he)NF-κB信號通路(lu)關鍵蛋(dan)?的磷酸(suan)(suan)化?平(ping)。如圖(tu)2所?，與陰性對照組(zu)相?，LPS刺激3 h后細(xi)胞(bao)中(zhong)p38、JNK和(he)p65蛋(dan)?的磷酸(suan)(suan)化?平(ping)顯著升?（P＜0.05）。90、120 μg/mL HFPs預(yu)處理(li)對LPS誘導(dao)的巨噬細(xi)胞(bao)中(zhong)p38和(he)p65的磷酸(suan)(suan)化產?顯著抑制作?（P＜0.05），且呈(cheng)?定的劑量依賴性，但(dan)對JNK的磷酸(suan)(suan)化沒(mei)有(you)顯著影響，表(biao)明(ming)HFPs的抗炎作?可能與其靶(ba)向作?于p38 MAPK和(he)NF-κB p65有(you)關。

總結(jie)

客戶采?LPS誘(you)導RAW264.7巨噬(shi)細(xi)胞建?體外炎癥模型(xing)，使?超(chao)聲波(bo)(bo)細(xi)胞粉碎機(ji)將蛋(dan)?及核酸從炎癥細(xi)胞中分(fen)離出來，從基因、蛋(dan)?相對(dui)表達?平??評估?棲菜多(duo)酚（Hizikia fusiformispolyphenols，HFPs）的抗炎活性，為其在新型(xing)抑炎制劑(ji)的開發利(li)?提供理論(lun)依據。超(chao)聲波(bo)(bo)細(xi)胞粉碎機(ji)在整個實驗中起到作?如下：

1. 輔(fu)助提取?棲菜(cai)中(zhong)多酚(fen)(fen)組分，加速多酚(fen)(fen)組分釋放，縮短了提取進程，后續(xu)通(tong)過凍?步驟(zou)即可(ke)獲得(de)?棲菜(cai)多酚(fen)(fen)粉末，溶解后備?；

2. 搭配TRIzol試劑對細(xi)胞中總RNA進(jin)?提(ti)取(qu)，試劑中含有苯(ben)酚(fen)，可加(jia)速細(xi)胞破碎和核酸(suan)釋放，還加(jia)?核酸(suan)酶抑制物質防?RNA降解，PCR結(jie)果表明提(ti)取(qu)的(de)RNA濃(nong)度與純度較(jiao)好，可?于相關基因表達(da)情況的(de)分析；

3. 搭配(pei)RIPA裂解(jie)(jie)液對細(xi)胞(bao)中的蛋?質進?提取(qu)，?幅減少原本(ben)冰上裂解(jie)(jie)所需時間（30 min），試劑(ji)中含有(you)的蛋?酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)可防?蛋?降(jiang)解(jie)(jie)，還含有(you)磷(lin)酸(suan)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji)，防?蛋?提取(qu)后的再修飾，更好測(ce)定蛋?磷(lin)酸(suan)化狀態。