實驗目的

為了(le)(le)解(jie)大鼠肺(fei)組(zu)織中炎癥(zheng)因子蛋(dan)白表(biao)達情(qing)況，需要將組(zu)織內的蛋(dan)白盡量(liang)釋放并收集(ji)，使用(yong)研磨和(he)超聲手段，對肺(fei)組(zu)織進行勻(yun)漿和(he)細胞破碎，最終(zhong)分(fen)離(li)得(de)到溶液中的蛋(dan)白進行WB實(shi)驗，從(cong)而了(le)(le)解(jie)蛋(dan)白表(biao)達情(qing)況。

實驗步驟

取(qu)(qu)0.2g大鼠右肺(fei)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣本，切碎，取(qu)(qu)適量溶解(jie)(jie)并混勻(yun)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)RIPA裂解(jie)(jie)液(ye)，使(shi)(shi)(shi)(shi)用(yong)前加(jia)(jia)入酶抑制劑，在(zai)每(mei)100 mg右肺(fei)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)樣本內(nei)加(jia)(jia)入 1 mL 的(de)(de)(de)(de)RIPA裂解(jie)(jie)液(ye)，后(hou)(hou)使(shi)(shi)(shi)(shi)用(yong)SCIENTZ-24高通(tong)量組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)研磨器(qi)將(jiang)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)充分研磨勻(yun)漿，于4℃的(de)(de)(de)(de)條件下(xia)裂解(jie)(jie)30～60 min，將(jiang)裂解(jie)(jie)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)(zhi)置(zhi)(zhi)于SCIENTZ-1500F超(chao)聲(sheng)分散(san)儀上(shang)(shang)破(po)碎，用(yong)高速離(li)心(xin)機10000r/min離(li)心(xin)10min，取(qu)(qu)上(shang)(shang)清(qing)液(ye)。提取(qu)(qu)總(zong)蛋(dan)(dan)(dan)白并利用(yong)BCA試劑盒測定總(zong)蛋(dan)(dan)(dan)白濃(nong)度(du)(du)，于100℃水中煮5min，使(shi)(shi)(shi)(shi)蛋(dan)(dan)(dan)白變性后(hou)(hou)，置(zhi)(zhi)于冰上(shang)(shang)使(shi)(shi)(shi)(shi)其驟冷，提取(qu)(qu)為實驗使(shi)(shi)(shi)(shi)用(yong)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白樣本，置(zhi)(zhi)于－20℃冰箱(xiang)中冷凍(dong)保存。使(shi)(shi)(shi)(shi)用(yong)蒸餾水清(qing)洗(xi)干凈灌膠玻璃板，豎(shu)直放置(zhi)(zhi)使(shi)(shi)(shi)(shi)其自然晾干。分別使(shi)(shi)(shi)(shi)用(yong)分離(li)膠、5%濃(nong)縮膠處理后(hou)(hou)，將(jiang)凝膠置(zhi)(zhi)于電(dian)泳槽進(jin)行電(dian)泳，電(dian)泳結(jie)束后(hou)(hou)將(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)白轉移到預先準備(bei)的(de)(de)(de)(de) NC 膜上(shang)(shang)，制備(bei)轉膜“三明治”，在(zai)電(dian)轉儀中轉膜結(jie)束后(hou)(hou)，搖(yao)床洗(xi)膜，封(feng)閉(bi)液(ye)封(feng)閉(bi)1～2 h倒(dao)掉封(feng)閉(bi)液(ye)，加(jia)(jia)入稀釋(shi)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)應(ying)抗體。在(zai)搖(yao)床上(shang)(shang)4℃過夜，TBS－T洗(xi)膜3次(ci)(ci)，每(mei)次(ci)(ci)10 min，加(jia)(jia)入二(er)抗。二(er)抗孵育結(jie)束后(hou)(hou)，于搖(yao)床上(shang)(shang)用(yong)TBST洗(xi)膜5～10min×3次(ci)(ci)。加(jia)(jia)ECL工作(zuo)液(ye)于印跡(ji)膜上(shang)(shang)30～60s，吸干發光(guang)液(ye)，置(zhi)(zhi)印跡(ji)膜于成像(xiang)分析儀自動成像(xiang)，軟件ImageJ分析蛋(dan)(dan)(dan)白條帶灰度(du)(du)值。

實驗結果

各組(zu)(zu)(zu)(zu)大鼠肺組(zu)(zu)(zu)(zu)織中(zhong)(zhong)IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋(dan)白(bai)(bai)表(biao)達(da)(da)情況(kuang)比(bi)較(jiao)(jiao)與空白(bai)(bai)組(zu)(zu)(zu)(zu)比(bi)較(jiao)(jiao)，模型(xing)組(zu)(zu)(zu)(zu)和假(jia) 貼組(zu)(zu)(zu)(zu)肺組(zu)(zu)(zu)(zu)織中(zhong)(zhong) IL－17、IL－22蛋(dan)白(bai)(bai)相(xiang)對表(biao)達(da)(da)量(liang)(liang)均(jun)明(ming)顯升(sheng)高(gao)(P均(jun)＜0.05)，IL－10、IL－35蛋(dan)白(bai)(bai)相(xiang)對表(biao) 達(da)(da)量(liang)(liang)均(jun)明(ming)顯降低(P均(jun)＜0.05) ; 與模型(xing)組(zu)(zu)(zu)(zu)和假(jia)貼組(zu)(zu)(zu)(zu)比(bi)較(jiao)(jiao)，地塞米(mi)松組(zu)(zu)(zu)(zu)、發酵組(zu)(zu)(zu)(zu)、非(fei)發酵組(zu)(zu)(zu)(zu)肺組(zu)(zu)(zu)(zu)織中(zhong)(zhong)IL－17、IL－22蛋(dan)白(bai)(bai)相(xiang)對表(biao)達(da)(da)量(liang)(liang)均(jun)明(ming)顯降低(P均(jun)＜0. 05)，IL－10、IL－35蛋(dan)白(bai)(bai)相(xiang)對表(biao)達(da)(da)量(liang)(liang)均(jun)明(ming)顯升(sheng)高(gao)( P均(jun)＜0.05) ; 地塞米(mi)松組(zu)(zu)(zu)(zu)、發酵組(zu)(zu)(zu)(zu)、非(fei)發酵組(zu)(zu)(zu)(zu)間(jian)各指標比(bi)較(jiao)(jiao)差異均(jun)無(wu)統計學意(yi)義( P均(jun)＞0.05)。

表1 空白組(zu)(zu)(zu)和支(zhi)氣管哮喘各組(zu)(zu)(zu)大鼠肺(fei)組(zu)(zu)(zu)織中(zhong)IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋(dan)白相對表達量比較(x±s)

圖一空白組(zu)和支氣管哮(xiao)喘各組(zu)大鼠肺組(zu)織中IL－17、IL－22、IL－10、IL－35蛋(dan)白表達電泳圖